http://147.96.1.15/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm
http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htm#introduccion
jueves, 24 de abril de 2008
jueves, 17 de abril de 2008
Hibridación Ac. Nucléicos, Southern y RFLP
http://www.ehu.es/biomoleculas/isotopos/blot.htm
http://translate.google.com.ar/translate?hl=es&langpair=en%7Ces&u=http://www.mun.ca/biology/scarr/Gr12-18.html
http://www.icampus.ucl.ac.be/courses/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/la-molecula-de-adn/molecula-ADN.html
http://www.monografias.com/trabajos20/biologia-molecular/biologia-molecular.shtml#metodos
http://html.rincondelvago.com/adn-hibridacion-y-reaccion-en-cadena-de-las-polimerasas.html
http://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/forensetec.htm#1
http://www.monografias.com/trabajos19/musaceas/musaceas.shtml#polifor
RFLP
jueves, 10 de abril de 2008
enzimas de restricción
http://www.icampus.ucl.ac.be/courses/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/Enzimas/enzimas-de-restricc.html
http://www.uprm.edu/biology/cursos/biologiageneral/EnzimasDNA.htm
abrupto:blunt o romo; cohesivo: pegajoso o sticky.
http://www.escience.ws/b572/L5/L5.htm
esta en ingles, pero tiene buenos gráficos.
http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_34.asp?cuaderno=34
es tipo pdf, muy buena.
Corte del ADN mediante enzimas de restricción:
Las enzimas de restricción (ERs) se usan como tijeras moleculares para cortar el ADN en sitios específicos. Estas endonucleasas reconocen una secuencia específica del ADN y lo cortan cerca o dentro del sitio de reconocimiento. Las ERs de uso más frecuente en el laboratorio reconocen secuencias de 4 a 6 pares de bases. Para un ADN en particular una ER producirá un número determinado de fragmentos dependiendo del número y de la localización de sus sitios de reconocimiento. Por esta razón las ERs constituyen una herramienta muy valiosa para caracterizar secuencias génicas. El análisis del patrón de digestión de determinados genes es una herramienta útil en el estudio de mutaciones ya que al modificarse la secuencia de un gen los sitios de corte resultan modificados. Actualmente el diagnóstico de algunas enfermedades genéticas como la hemocromatosis se efectúa analizando el patrón de digestión de un trozo de ADN específico. Las ERs son también de gran utilidad para "clonar" fragmentos de ADN, tal como se describe más adelante.
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/restriction.html
Buenas animaciones de distintas técnicas.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen el ADN. Estos sistemas, llamados de modificación-restricción, son análogos a un sistema inmune, los cuales probablemente evolucionaron como un mecanismo de protección de los microorganismos contra infecciones virales. En efecto, las bacterias, por ejemplo, son infectadas por virus, llamados bacteriófagos, que inyectan su propio ADN en la célula bacteriana para después controlar su maquinaria celular y redirigirla hacia la síntesis de sus propios componentes, dando como resultado final la ruptura de la célula y la liberación de cientos o miles de nuevos virus. En algunas bacterias el ADN propio está modificado en ciertas secuencias. Una enzima de modificación se desliza sobre la hebra de ADN, y cada vez que se topa con su secuencia blanco, por ejemplo GAATTC, introduce un pequeño grupo químico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima de restricción, también se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la secuencia GAATTC, corta el ADN en esa posición. La enzima, sin embargo, no corta el ADN modificado, por lo que efectivamente es capaz de degradar el ADN extraño que puede entrar a la célula, sin alterar el ADN propio.
Hoy en día conocemos miles de diferentes enzimas de restricción, provenientes de otros tantos distintos microorganismos. Más de cien distintas secuencias pequeñas de ADN pueden ser rotas, específicamente, por medio del uso de la adecuada enzima de restricción.
Otra interesante propiedad de las enzimas de restricción es que, en general, reconocen secuencias palindrómicas, es decir; secuencias que son iguales si se leen en una dirección, o en la dirección contraria. Por ejemplo:
— 5´GAATTC3´—
— 3´CTTAAG5´—
es una secuencia palindrómica. Cuando actúa la enzima que reconoce y corta esta secuencia, llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con extremos que se proyectan fuera de la doble cadena:
— 5´G AATTC3´—
— 3´CTTAA G5´—
Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a aparearse o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo de ADN generado por un corte con EcoRI puede hibridarse o aparearse con otro extremo generado por la misma enzima.
Los descubridores de las primeras enzimas de restricción pronto se dieron cuenta de que su acción sobre el ADN (comúnmente llamada "digestión") producía un conjunto definido de diferentes segmentos. Esto es particularmente fácil de detectar si la digestión se efectúa sobre una molécula pequeña; y tales moléculas existen en la naturaleza. Por ejemplo, ciertos virus están constituidos por genomas muy pequeños. El virus SV4O (que ocasiona cáncer en los simios) contiene una molécula de ADN circular de unos 5 mil pares de bases. Muchas bacterias portan pequeñas moléculas de ADN, llamadas plásmidos, que llevan información accesoria a su cromosoma. Estas moléculas pueden tener también sólo unos miles de nucleótidos. Si se somete el producto de digestión de una de estas moléculas a una separación por electroforesis, después de utilizar la enzima de restricción, se observa un patrón de bandas, que corresponde a los fragmentos de ADN de tamaños correspondientes a la distancia entre un sitio y otro. El principio del proceso es análogo a la separación de proteínas (véase el recuadro II.1).
http://www.arrakis.es/~ibrabida/vigcorte.html
8.- Endonucleasas de restricción
En la tecnología del DNA recombinante "in vitro", tanto el DNA que contiene la secuencia diana como el vector de clonación deben cortarse de forma reproducible en fragmentos más pequeños. Si aplicamos ultrasonidos al DNA cromosomal obtenemos fragmentos de DNA de doble cadena que van desde los 0,3 a los 5 pares de kilobases en longitud. Desgraciadamente, este procedimiento tan sencillo produce roturas aleatorias, por lo que cada vez que se trata una muestra de DNA se obtienen diferentes fragmentos.
Hasta que no se descubrieron las endonucleasas de restricción no fué posible trabajar en clonación. Las endonucleasas de restricción son unos enzimas bacterianos que cortan internamente las moléculas de DNA de una forma específica que viene determinada por la secuencia de los pares de bases. Una de las primeras endonucleasas de restricción que se caracterizó fué de la bacteria Escherichia coli y se designó EcoRI. Estas enzimas se denominan con el nombre del género en letras mayúsculas seguido de las dos primeras letras del nombre de la especie en minúscula, utilizándose números romanos para designar el orden de caracterización de diferentes endonucleasas de restricción del mismo organismo (HpaI, HpaII de Haemophilus parainfluenzae).
La EcoRI se une a una región del DNA con una secuencia palindrómica específica (las dos cadenas son idénticas cuando se leen en la misma polaridad, por ejemplo 5'-->3'; un palíndromo es un conjunto de caracteres que se lee lo mismo de derecha a izquierda que de izquierda a derecha y deriva del griego que quiere decir "andar de nuevo para atrás"; ROMA:AMOR) de seis pares de bases y la corta entre los residuos de guanina y adenina de cada cadena; cortando específicamente el enlace internucleotídico entre el oxígeno del carbono 3' del azúcar de un nucleótido y el grupo fosfato unido al carbono 5' del azúcar del nucleótido adyacente. Este corte simétrico del DNA por EcoRI produce dos cadenas sencillas con los extremos complementarios y cada una con una extensión de cuatro nucleótidos. En este caso, cada extensión de la cadena sencilla finaliza en un grupo fosfato 5' mientras que el grupo 3' hidroxilo está retirado. Las secuencias palindrómicas donde se unen y posteriormente cortan las endonucleasas de restricción se llaman secuencias de reconocimiento.
Algunas endonucleasas de restricción cortan el DNA originando extensiones fosfato 5', otras originan extensiones hidroxilo 3' (extremos pegajosos; sticky ends); mientras que otras cortan ambas cadenas dentro de una secuencia de reconocimiento produciendo extremos sin protuberancias (extremos despuntados; blunt ends).
La longitud de la secuencia de reconocimiento para diferentes enzimas puede ser de 4, 5, 6, 8 ó más pares de nucleótidos. Debido a la frecuencia con la cual aparecen en el DNA estas secuencias de reconocimiento se suelen utilizar en clonación las endonucleasas de restricción que cortan secuencias de 4 y 6 pares de nucleótidos.
La importancia de este tipo de endonucleasas de restricción viene determinada por el hecho de que la misma muestra de DNA tratada con uno de estos enzimas producirá los mismos fragmentos, asumiendo que todos los sitios de reconocimiento para ese enzima son cortados. Además pueden construirse mapas físicos (mapas de restricción) que designan el orden lineal de los sitios de restricción sobre un trozo específico de DNA.
Estos mapas de restricción se obtienen al tratar la molécula de DNA con diferentes enzimas de restricción (uno cada vez) y después con una combinación de ellos. Las posiciones de los sitios de corte se pueden deducir mediante el análisis del tamaño de los fragmentos, los cuales se determinan por electroforesis en gel de agarosa. Por ejemplo, los fragmentos producidos por la digestión de EcoRI, Bam HI y la mezcla de los dos se muestran en la figura. Se deduce de la electroforesis que esta pieza de DNA tiene dos sitios de corte Bam HI y dos sitios de corte EcoRI en un orden específico con un específico número de pares de bases separando los cortes (1 corte ------> 2 fragmentos; 2 cortes ------> 3 fragmentos). El mapa de restricción se formula al comparar el tamaño de los fragmentos producidos en cada digestión sencilla con aquellos que se obtienen de la doble digestión. En el ejemplo de la figura el análisis sería:
Debido a que cada digestión sencilla produce 3 fragmentos de una molécula lineal de DNA, la pieza original debe contener 2 sitios de corte para cada una de las endonucleasas de restricción. El fragmento de 300 pb obtenido con EcoRI permanece intacto después de la doble digestión, mientras que el de 850 pb y 500 pb se cortan. Por lo que los dos cortes EcoRI están separados por 300 pb sin ningún sitio de corte Bam HI dentro de cada uno de los fragmentos de EcoRI (850 y 500 pb). El fragmento de 950 pb que se produce por la digestión con Bam HI se corta con EcoRI en la doble digestión en 3 piezas (250 + 300 + 400 = 950 pb). Por lo tanto, los dos cortes Bam HI se encuentran a 250 y 400 pb de cada uno de los cortes de EcoRI. La digestión con Bam HI rompe el fragmento de 850 pb de EcoRI en dos fragmentos de 250 y 600 pb y ya hemos visto que uno de los cortes de EcoRI está a 250 pb del corte de Bam HI; por lo tanto la región de 600 pb debe incluir uno de los extremos de la molécula. Usando la misma lógica comprobamos que la digestión con Bam HI corta el fragmento EcoRI de 500 pb en dos fragmentos de 100 pb y 400 pb y como uno de los sitios de corte de EcoRI está a 400 pb del sitio Bam HI, la región Bam HI de 100 pb debe incluir el otro extremo de la molécula. En el mapa final obtenido, las localizaciones de los sitios de restricción son consistentes con la longitud de los fragmentos que hemos obtenido en cada una de las digestiones.
Las endonucleasas de restricción también se pueden usar con otros motivos. Cuando dos muestras diferentes de DNA se digieren con la misma endonucleasa de restricción que origina extremos pegajosos y posteriormente se mezclan, se pueden formar nuevas combinaciones de DNA como resultado del apareamiento de bases de los extremos.
Las enzimas de restricción solas no son suficientes en la clonación ya que cuando se alinean los extremos pegajosos, los puentes de H2 de las bases que se aparean no son lo suficientemente fuertes como para mantener dos moléculas de DNA unidas. Es necesaria la unión internucleotídica entre el grupo hidroxilo 3' y el grupo fosfato 5' de los dos sitios de corte. Este problema puede resolverse usando el enzima DNA ligasa, normalmente del bacteriófago T4. Este enzima cataliza la formación de enlaces fosfodiester entre los extremos de las cadenas de DNA que ya están unidas por el apareamiento de bases de dos extensiones. Incluso une dos extremos sin punta que se ponen en contacto cuando ambos se unen al enzima.
http://www.uprm.edu/biology/cursos/biologiageneral/EnzimasDNA.htm
abrupto:blunt o romo; cohesivo: pegajoso o sticky.
http://www.escience.ws/b572/L5/L5.htm
esta en ingles, pero tiene buenos gráficos.
http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_34.asp?cuaderno=34
es tipo pdf, muy buena.
Corte del ADN mediante enzimas de restricción:
Las enzimas de restricción (ERs) se usan como tijeras moleculares para cortar el ADN en sitios específicos. Estas endonucleasas reconocen una secuencia específica del ADN y lo cortan cerca o dentro del sitio de reconocimiento. Las ERs de uso más frecuente en el laboratorio reconocen secuencias de 4 a 6 pares de bases. Para un ADN en particular una ER producirá un número determinado de fragmentos dependiendo del número y de la localización de sus sitios de reconocimiento. Por esta razón las ERs constituyen una herramienta muy valiosa para caracterizar secuencias génicas. El análisis del patrón de digestión de determinados genes es una herramienta útil en el estudio de mutaciones ya que al modificarse la secuencia de un gen los sitios de corte resultan modificados. Actualmente el diagnóstico de algunas enfermedades genéticas como la hemocromatosis se efectúa analizando el patrón de digestión de un trozo de ADN específico. Las ERs son también de gran utilidad para "clonar" fragmentos de ADN, tal como se describe más adelante.
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/restriction.html
Buenas animaciones de distintas técnicas.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen el ADN. Estos sistemas, llamados de modificación-restricción, son análogos a un sistema inmune, los cuales probablemente evolucionaron como un mecanismo de protección de los microorganismos contra infecciones virales. En efecto, las bacterias, por ejemplo, son infectadas por virus, llamados bacteriófagos, que inyectan su propio ADN en la célula bacteriana para después controlar su maquinaria celular y redirigirla hacia la síntesis de sus propios componentes, dando como resultado final la ruptura de la célula y la liberación de cientos o miles de nuevos virus. En algunas bacterias el ADN propio está modificado en ciertas secuencias. Una enzima de modificación se desliza sobre la hebra de ADN, y cada vez que se topa con su secuencia blanco, por ejemplo GAATTC, introduce un pequeño grupo químico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima de restricción, también se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la secuencia GAATTC, corta el ADN en esa posición. La enzima, sin embargo, no corta el ADN modificado, por lo que efectivamente es capaz de degradar el ADN extraño que puede entrar a la célula, sin alterar el ADN propio.
Hoy en día conocemos miles de diferentes enzimas de restricción, provenientes de otros tantos distintos microorganismos. Más de cien distintas secuencias pequeñas de ADN pueden ser rotas, específicamente, por medio del uso de la adecuada enzima de restricción.
Otra interesante propiedad de las enzimas de restricción es que, en general, reconocen secuencias palindrómicas, es decir; secuencias que son iguales si se leen en una dirección, o en la dirección contraria. Por ejemplo:
— 5´GAATTC3´—
— 3´CTTAAG5´—
es una secuencia palindrómica. Cuando actúa la enzima que reconoce y corta esta secuencia, llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con extremos que se proyectan fuera de la doble cadena:
— 5´G AATTC3´—
— 3´CTTAA G5´—
Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a aparearse o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo de ADN generado por un corte con EcoRI puede hibridarse o aparearse con otro extremo generado por la misma enzima.
Los descubridores de las primeras enzimas de restricción pronto se dieron cuenta de que su acción sobre el ADN (comúnmente llamada "digestión") producía un conjunto definido de diferentes segmentos. Esto es particularmente fácil de detectar si la digestión se efectúa sobre una molécula pequeña; y tales moléculas existen en la naturaleza. Por ejemplo, ciertos virus están constituidos por genomas muy pequeños. El virus SV4O (que ocasiona cáncer en los simios) contiene una molécula de ADN circular de unos 5 mil pares de bases. Muchas bacterias portan pequeñas moléculas de ADN, llamadas plásmidos, que llevan información accesoria a su cromosoma. Estas moléculas pueden tener también sólo unos miles de nucleótidos. Si se somete el producto de digestión de una de estas moléculas a una separación por electroforesis, después de utilizar la enzima de restricción, se observa un patrón de bandas, que corresponde a los fragmentos de ADN de tamaños correspondientes a la distancia entre un sitio y otro. El principio del proceso es análogo a la separación de proteínas (véase el recuadro II.1).
http://www.arrakis.es/~ibrabida/vigcorte.html
8.- Endonucleasas de restricción
En la tecnología del DNA recombinante "in vitro", tanto el DNA que contiene la secuencia diana como el vector de clonación deben cortarse de forma reproducible en fragmentos más pequeños. Si aplicamos ultrasonidos al DNA cromosomal obtenemos fragmentos de DNA de doble cadena que van desde los 0,3 a los 5 pares de kilobases en longitud. Desgraciadamente, este procedimiento tan sencillo produce roturas aleatorias, por lo que cada vez que se trata una muestra de DNA se obtienen diferentes fragmentos.
Hasta que no se descubrieron las endonucleasas de restricción no fué posible trabajar en clonación. Las endonucleasas de restricción son unos enzimas bacterianos que cortan internamente las moléculas de DNA de una forma específica que viene determinada por la secuencia de los pares de bases. Una de las primeras endonucleasas de restricción que se caracterizó fué de la bacteria Escherichia coli y se designó EcoRI. Estas enzimas se denominan con el nombre del género en letras mayúsculas seguido de las dos primeras letras del nombre de la especie en minúscula, utilizándose números romanos para designar el orden de caracterización de diferentes endonucleasas de restricción del mismo organismo (HpaI, HpaII de Haemophilus parainfluenzae).
La EcoRI se une a una región del DNA con una secuencia palindrómica específica (las dos cadenas son idénticas cuando se leen en la misma polaridad, por ejemplo 5'-->3'; un palíndromo es un conjunto de caracteres que se lee lo mismo de derecha a izquierda que de izquierda a derecha y deriva del griego que quiere decir "andar de nuevo para atrás"; ROMA:AMOR) de seis pares de bases y la corta entre los residuos de guanina y adenina de cada cadena; cortando específicamente el enlace internucleotídico entre el oxígeno del carbono 3' del azúcar de un nucleótido y el grupo fosfato unido al carbono 5' del azúcar del nucleótido adyacente. Este corte simétrico del DNA por EcoRI produce dos cadenas sencillas con los extremos complementarios y cada una con una extensión de cuatro nucleótidos. En este caso, cada extensión de la cadena sencilla finaliza en un grupo fosfato 5' mientras que el grupo 3' hidroxilo está retirado. Las secuencias palindrómicas donde se unen y posteriormente cortan las endonucleasas de restricción se llaman secuencias de reconocimiento.
Algunas endonucleasas de restricción cortan el DNA originando extensiones fosfato 5', otras originan extensiones hidroxilo 3' (extremos pegajosos; sticky ends); mientras que otras cortan ambas cadenas dentro de una secuencia de reconocimiento produciendo extremos sin protuberancias (extremos despuntados; blunt ends).
La longitud de la secuencia de reconocimiento para diferentes enzimas puede ser de 4, 5, 6, 8 ó más pares de nucleótidos. Debido a la frecuencia con la cual aparecen en el DNA estas secuencias de reconocimiento se suelen utilizar en clonación las endonucleasas de restricción que cortan secuencias de 4 y 6 pares de nucleótidos.
La importancia de este tipo de endonucleasas de restricción viene determinada por el hecho de que la misma muestra de DNA tratada con uno de estos enzimas producirá los mismos fragmentos, asumiendo que todos los sitios de reconocimiento para ese enzima son cortados. Además pueden construirse mapas físicos (mapas de restricción) que designan el orden lineal de los sitios de restricción sobre un trozo específico de DNA.
Estos mapas de restricción se obtienen al tratar la molécula de DNA con diferentes enzimas de restricción (uno cada vez) y después con una combinación de ellos. Las posiciones de los sitios de corte se pueden deducir mediante el análisis del tamaño de los fragmentos, los cuales se determinan por electroforesis en gel de agarosa. Por ejemplo, los fragmentos producidos por la digestión de EcoRI, Bam HI y la mezcla de los dos se muestran en la figura. Se deduce de la electroforesis que esta pieza de DNA tiene dos sitios de corte Bam HI y dos sitios de corte EcoRI en un orden específico con un específico número de pares de bases separando los cortes (1 corte ------> 2 fragmentos; 2 cortes ------> 3 fragmentos). El mapa de restricción se formula al comparar el tamaño de los fragmentos producidos en cada digestión sencilla con aquellos que se obtienen de la doble digestión. En el ejemplo de la figura el análisis sería:
Debido a que cada digestión sencilla produce 3 fragmentos de una molécula lineal de DNA, la pieza original debe contener 2 sitios de corte para cada una de las endonucleasas de restricción. El fragmento de 300 pb obtenido con EcoRI permanece intacto después de la doble digestión, mientras que el de 850 pb y 500 pb se cortan. Por lo que los dos cortes EcoRI están separados por 300 pb sin ningún sitio de corte Bam HI dentro de cada uno de los fragmentos de EcoRI (850 y 500 pb). El fragmento de 950 pb que se produce por la digestión con Bam HI se corta con EcoRI en la doble digestión en 3 piezas (250 + 300 + 400 = 950 pb). Por lo tanto, los dos cortes Bam HI se encuentran a 250 y 400 pb de cada uno de los cortes de EcoRI. La digestión con Bam HI rompe el fragmento de 850 pb de EcoRI en dos fragmentos de 250 y 600 pb y ya hemos visto que uno de los cortes de EcoRI está a 250 pb del corte de Bam HI; por lo tanto la región de 600 pb debe incluir uno de los extremos de la molécula. Usando la misma lógica comprobamos que la digestión con Bam HI corta el fragmento EcoRI de 500 pb en dos fragmentos de 100 pb y 400 pb y como uno de los sitios de corte de EcoRI está a 400 pb del sitio Bam HI, la región Bam HI de 100 pb debe incluir el otro extremo de la molécula. En el mapa final obtenido, las localizaciones de los sitios de restricción son consistentes con la longitud de los fragmentos que hemos obtenido en cada una de las digestiones.
Las endonucleasas de restricción también se pueden usar con otros motivos. Cuando dos muestras diferentes de DNA se digieren con la misma endonucleasa de restricción que origina extremos pegajosos y posteriormente se mezclan, se pueden formar nuevas combinaciones de DNA como resultado del apareamiento de bases de los extremos.
Las enzimas de restricción solas no son suficientes en la clonación ya que cuando se alinean los extremos pegajosos, los puentes de H2 de las bases que se aparean no son lo suficientemente fuertes como para mantener dos moléculas de DNA unidas. Es necesaria la unión internucleotídica entre el grupo hidroxilo 3' y el grupo fosfato 5' de los dos sitios de corte. Este problema puede resolverse usando el enzima DNA ligasa, normalmente del bacteriófago T4. Este enzima cataliza la formación de enlaces fosfodiester entre los extremos de las cadenas de DNA que ya están unidas por el apareamiento de bases de dos extensiones. Incluso une dos extremos sin punta que se ponen en contacto cuando ambos se unen al enzima.
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