Tenicas de biologia molecular en general

http://darwin.usal.es/profesores/pfmg/sefin/MI/tema11MI.html

Protocolo corte con enzima de restricción

Teoría de corte con enzimas de restricción

La restricción de plásmidos, tiene dos propósitos uno es diagnóstico, el otro es preparativo.
El corte de diagnóstico, me permite determinar si el fragmento de DNA que cloné esta al derecho, o al reves.
El corte preparativo, me sirve para extraer el fragmento que cloné con el fin de subclonarlo, utilizarlo como sonda, etc.
¿Cuándo puede ocurrir que el fragmento se clone al revés?
Cuando se clona en un sitio “blunt end”, o producto del corte con una sola enzima de restricción.

Corte diagnóstico

a) al “derecho”





Porque pasa esto, dado que los sitios de restricción son fijos en cada fragmento, si varia la orientación espacial, entonces la distancia se incrementará (como en el dibujo).
En un gel de agarosa entonces podré ver la diferencia entre un tipo de banda y otro.


Según sea el uso que vaya a darle al fragmento, será necesario optar por uno u otro.
Si es para secuenciar, no importa la orientación del fragmento, si es un plásmido de expresión, o debo extraer la banda para subclonar entonces si importa la orientación.

PROTOCOLO CORTE CON ENZIMA DE RESTRICCION


Se cortarán ~ 2 ug de plásmido por reacción.
Elementos:
4 tubos eppendorf rotulados A, B, C y D
Micropipetas 1-20 uL.
Tips
H2O deionizada.
Plásmidos A, B, C y D.
React Buffer según cada reacción
Enzima necesarias.

Procedimiento:

En cada tubo rotulado se coloca:

DNA plásmido:…………………………csp 1ug.
Buffer React 10X…………………….. 2 uL.
Enzimas ………………………………... 1 uL c/u
H20 deionizada csp……………………..20 uL.

Se pone a incubar en baño a 37º C durante 3 h.
Se guarda hasta próxima clase en freezer – 20ºC.

Textos sobre clonado y transformación

Clonado transformación y sistemas de expresión.

Nos referiremos al clonado de fragmentos de DNA en vectores plásmidicos.
Habíamos visto en la última clase que había dos tipos de vectores plásmidicos, los de clonado, y los de expresión.
, los de clonado sirven como: “PCR” biológica, para obtener una banda de DNA a ser utilizada como sonda o para subclonar en otro vector.
En el apunte de la experiencia de corte con enzima de restricción, hay un gráfico y una breve explicación de cómo se introducen fragmentos de DNA en los vectores (se complementa con alguna de las páginas web que les envié).
Si se acuerdan habíamos visto que las enzimas de restricción podían dejar extremos sticky o romos.
Para el clonado se procede de la siguiente manera, en un tubo eppendorf se colocan el vector digerido con la/s enzima/s de restricción y fosfataseado (se le sacan los fosfatos con alguna de las fosfatasas), esto se hace para evitar todo lo posible que el vector se religue (se cierre sin incorporar el fragmento de interés), en la experiencia de transformación se pone una caja de control que tiene la bacteria transformada con el plásmido digerido y fosfataseado para ver cuanto se religa (se le llama self ligation).
Seguimos con la experiencia de clonado, se agrega el fragmento digerido con la/s misma/s enzima/s que el vector al tubo donde ya tenía lo anterior y por ultimo se agregan el buffer de ligación y la ligasa, se incuba según lo indique el instructivo de la enzima ligasa.
Si usé dos enzimas distintas para digerir el vector y el fragmento, este se clonará en una orientación definida, que dependerá de la posición relativa de los sitios de restricción en el fragmento y en el vector (vean el grafico de la explicación práctica).
Si por la naturaleza del fragmento, o del vector uno se ve obligado a usar una sola enzima de restricción sea esta sticky o blunt, el fragmento podrá entrar en el vector en dos orientaciones posibles, cabeza (extremo 5’) – cola (extremo 3’), o a la inversa (cola-cabeza). Esta es la base de la práctica que haremos el 4/06, serán dos digestiones, una de diagnóstico (para ver si el fragmento está al derecho o al revés), y otra preparativa ó analítica, que sería para extraer el fragmento completo (para usar como sonda o para subclonar).

Transformación
Se le llama así al proceso de introducir DNA en una célula o bacteria, para las bacterias se le dice así. Para las células eucariotas se habla de transfección si es DNA desnudo, y de transducción si se trata de introducir el fragmento integrando el material genético de un virus (Para más información remítanse al apunte sobre transformación ya enviado)
Nosotros vamos a transformar bacterias, que cuando están tratadas para aceptar el DNA exógeno, se llaman competentes. Este estado se obtiene tratando a la bacteria con una solución que contiene CaCl2 , esto abre en la membrana plasmática poros por donde puede ingresar el DNA. Una vez que se hizo esto las bacterias se dejan un rato en recuperación en medio líquido, y luego se pueden plaquear en caja de petri con el atb que corresponda para seleccionar.

Sistemas de Expresión
Este nombre se le da al conjunto formado por el vector + el huésped (célula o bacteria).
El sistema de expresión se elegirá según las características de la proteína a expresar.
(profundizaremos este concepto en clase).
En células eucariotas la expresión puede ser transitoria (transiente) (si el vector no se integra en el material genético del huésped) o estable (si el vector se integra en el material genético del huésped). En las bacterias el vector siempre está como episoma (nunca se integra en el material genético del huésped), y se replica de manera independiente ya que tiene, como hemos visto, origen de replicación propio.

1º Dia

¿Qué es la transformacion bacteriana?

El proceso consiste en la introducción de un ADN extraño (heterólogo) a una bacteria.
Este proceso se puede dar por tres métodos:
• Transformacion con ADN desnudo en presencia de CaCl2.
• Transducción: Introducción de DNA mediada por un bacteriofago.
• Electroporación: El DNA se introduce en las bacterias forzandolo con una descarga eléctrica (se usa en gram + y células eucariotas vegetales o de hongos {que tienen pared celular}).
Para las células eucariotas no vegetales ni de hongos, se usa la transfección, que consiste en precipitar el DNA junto con las células y Ca3(PO4)2, también se usa la microinyección, donde se introduce el DNA directamente al núcleo de la célula.
Para células vegetales otra forma de introducir DNA es através del llamado cañón génico, que impulsa con gas comprimido a gran presión microparticulas de tungsteno u oro (metales relativamente inertes desde el pto. de vista químico) recubiertas con una solución del DNA que se quiere introducir.
El kit con el que vamos a trabajar, usa el primero de los métodos reseñados.
Para poder tomar el DNA, las bacterias tienen que estar en un estado llamado de “competencia”, que se logra tratando a las mismas con soluciones ricas en Ca2+ de manera tal que se le abren poros a la pared y la membrana celular por donde ingresará el DNA.
Una vez adentro, el DNA puede integrarse al material génetico de la bacteria (o célula), o permanecer autónomo con respecto al mismo (episómico)(en eucariotas es mas frecuente la integración a los cromosomas, pero hay ocasiones en las cuales es deseable la no integración del DNA, asi que el fragmento se mantiene indep’te del DNA celular y se le llama transiente).
En nuestro caso el material introducido, se mantendrá episómico. Asi, se replicará autonomamente.
El material a utilizar se llama plásmido, y consiste en una estructura circular de DNA dc (de entre 2600 a 6000 pb) que porta la siguiente información:
1. Un origen de replicación
2. Una secuencia de control de nº de copias
3. Un gen (con su correspondiente promotor) de resistencia a un antibiotico
4. Un promotor (gral’te inducible, derivado del operon Lac)
5. Un sitio múltiple de clonado (polilinker)
Cada uno de estos elementos cumple una función específica.
El 1º conocido como ORI permite la replicación autónoma del DNA.
El 2º controla cuantas copias tendra el plásmido dentro de la bacteria (desde ~16/bact para pET, hasta ~600/bact para pUC18).
El 3º es un gen que produce una proteina que facilita a la bacteria resistir la acción de un antibiótico y funciona como agente de selección, esto es, permite distinguir en presencia del agente selector (antibiótico)a las bacterias que hayan incorporado el DNA de aquellas que no lo hayan hecho. Antibióticos utilizados son por ejemplo: ampicilina (BLA), kanamicina (APT) , tetraciclina, cloramfenicol (CAT), etc.
El 4º sirve para poder expresar, usando la maquinaria de trancripción y de biosintesis de proteinas de la bacteria, una proteina de nuestro intéres.
El que sea inducible me permite seleccionar el momento más adecuado para la expresión.
El 5º es una secuencia de DNA que tiene muchos sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, donde uno puede clonar el gen de la proteina que interesa expresar.

La bacteria competente, al igual que el plásmido es provista por el kit.
Generalmente, son cepas (strain) de E.coli tales como: HB101, JM105, LE392, DH5α, BL21DE3, etc.
Este kit hace uso del sistema de regulación génica del operon ARA, promotor ARA BAD y gen de la proteina Ara C.
La proteina GFP, extraida de una medusa, tiene la propiedad de fluorescer de color verde brillante, cuando es iluminada con luz UV.
A este tipo de productos génicos, se los llama genes (proteinas) reporter, ya que permiten verificar de manera sencilla su presencia ya que provocan algun efecto óptico o de otra naturaleza cuando se producen.
Genes reporter son p.ej.: GFP, β-galactosidasa, β-glucoronico, luciferina, etc.
El proceso concretamente, consiste en tomar 2 tubos eppendorf rotulados (–) DNA y (+) DNA donde se colocará solución de CaCl2 .
Una vez hecho esto, de una placa de petri sembrada con la bacteria se toma una ansada y se disuelve en cada tubo.
Una vez bien disueltas las bacterias en la solución, se tapa el tubo (-)DNA y al (+)DNA se le agrega una ansada de plásmido pGLO.
Los dos tubos se colocan 10’ en hielo, y luego de 50” a 1’30” a 42ºC. Se recuperan las bacterias transformadas 30’ a 37ºC con medio LB (caldo de Luria-Bertani, triptona 10 g, extracto de levadura 5g, NaCl 10 g, H2O csp 1000 mL).
Por último se plaquearán las bacterias transformadas en cajas de petri, con agar LB (idem caldo LB + 1.5% agar) + arabinosa.
Se ponen las cajas en estufa de 37ºC overnight.

2º Dia

Ver si crecieron las bacterias en las placas.
Tomar las placas rotuladas +)DNA e iluminarla con luz UV, observar el resultado. Comparar lo que se ve en una y otra placa.

Protocolo Transformacion bacteriana

para cada grupo

Celulas competentes ...............................................................1 vial c/ 250 uL de bact. comp.
Plasmido/s a transformar.........................................................1vial con x uL de DNA 1 ng/uL
Caldo LB.........................................................................................10 mL esteril.
Placas de petri..............................................................................2 placas con agar LB ampi, 1 con agar LB ampi + ara (0.15 ml sln. ara 20%).
Hielo .................................................................................................1 cuba.
Pipetas..............................................................................................1 de 20 ul y otra de 200 ul.
Tips esteriles...................................................................................10.
baño 37º a 42º .................................................................................1
Eppendorfs .......................................................................................2, rotulados -DNA y +DNA.
Mecheros............................................................................................1 cada 2 grupos.
rastrillo de drigalsky........................................................................1
Alcohol para flamear .......................................................................1 vaso de precipitado con 50 mL.
Procedimiento.
Todo bajo mechero.
Se toman los eppendorfs y se rotulan convenientemente (- o + DNA y la identificación del grupo).
Las bact. comp se llevan en hielo a la mesada de trabajo
Se alicuotan 50 uL de bact en el tubo - DNA y 40 uL para el + DNA.
Se dejan en hielo.
Se toman 10 uL de la solución 1ug/uL de DNA y se mezcla con las bact del tubo + DNA.
Se incuban ambos tubos en hielo 30 minutos.
Pasado ese lapso, los tubos se colocan a 42º C (shock térmico) durante 1½ minuto.
Se sacan de allí, y se les añaden 200 uL de caldo LB esteril.(recuperación).
Se incuba 1 hora a 37ºC y se plaquea bajo mechero 100 uL de cultivo en las cajas correspondientes. Se rastrilla las placas y se las cierra, poniendolas luego boca abajo.
Se incuban overnight a 37º C.