Protocolo Transformacion bacteriana

para cada grupo

Celulas competentes ...............................................................1 vial c/ 250 uL de bact. comp.
Plasmido/s a transformar.........................................................1vial con x uL de DNA 1 ng/uL
Caldo LB.........................................................................................10 mL esteril.
Placas de petri..............................................................................2 placas con agar LB ampi, 1 con agar LB ampi + ara (0.15 ml sln. ara 20%).
Hielo .................................................................................................1 cuba.
Pipetas..............................................................................................1 de 20 ul y otra de 200 ul.
Tips esteriles...................................................................................10.
baño 37º a 42º .................................................................................1
Eppendorfs .......................................................................................2, rotulados -DNA y +DNA.
Mecheros............................................................................................1 cada 2 grupos.
rastrillo de drigalsky........................................................................1
Alcohol para flamear .......................................................................1 vaso de precipitado con 50 mL.
Procedimiento.
Todo bajo mechero.
Se toman los eppendorfs y se rotulan convenientemente (- o + DNA y la identificación del grupo).
Las bact. comp se llevan en hielo a la mesada de trabajo
Se alicuotan 50 uL de bact en el tubo - DNA y 40 uL para el + DNA.
Se dejan en hielo.
Se toman 10 uL de la solución 1ug/uL de DNA y se mezcla con las bact del tubo + DNA.
Se incuban ambos tubos en hielo 30 minutos.
Pasado ese lapso, los tubos se colocan a 42º C (shock térmico) durante 1½ minuto.
Se sacan de allí, y se les añaden 200 uL de caldo LB esteril.(recuperación).
Se incuba 1 hora a 37ºC y se plaquea bajo mechero 100 uL de cultivo en las cajas correspondientes. Se rastrilla las placas y se las cierra, poniendolas luego boca abajo.
Se incuban overnight a 37º C.